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PCR扩增产物鉴定与纯化实验原理及实验过程

[2015/3/24]

实验原理

琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。(原理参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验)

 

本实验使用了TaKaRa公司的胶纯化试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit),该试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统,结合DNA制备膜技术,具有高效、快速、方便的特点,全套操作只需30min便可完成。使用该试剂盒每次可纯化得到多至10µgDNA片段(100bp30kb),回收率高达5080%。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高,完整性好,可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。

 

经胶纯化试剂盒回收的DNA片段采用-20℃低温保存,延缓DNA的降解。

 

实验试剂

1. PCR扩增产物

2. Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa)

3. 琼脂糖

4. 1×TAE

5. 6×Loading Buffer

6. DNA Marker 2000

 

实验设备

1. 琼脂糖凝胶电泳系统

2. 紫外透射仪

3. 台式离心机

4. 移液枪(配套枪头)

5. -20℃低温冰箱

6. 分析天平

 

实验材料

1. 单面刀片

2. 纯化试剂盒

3. 1.5mL离心管

4. 超纯水(无菌)

 

实验步骤

1. 使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。(参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验)

2. 在紫外灯下切出含有目的DNA(约600bp)的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,尽量减小凝胶体积,提高DNA回收率。

     注意:切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下,以防止DNA损伤。

3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间,提高DNA的回收率。

4. 称量胶块重量,计算胶块体积。计算胶块体积时,以1mg=1µL进行计算。

5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer,DR-I Buffer的加量如下表:

 

凝胶浓度     DR-I Buffer 使用量  

1%                 3个凝胶体积量 

1%-1.5%       4个凝胶体积量 

1.5%-2%       5个凝胶体积量

 

6. 均匀混合后75℃加热,融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。此时应间断振荡混合,使胶块充分融化(约610分钟)。

注意:胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA的回收率。

7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer,均匀混合。当分离小于400 bpDNA片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。

8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中,12000 rpm离心1min,弃滤液。

注意:如将滤液再加入Spin Column中离心一次,可以提高DNA的回收率。

10. 500 µLRinse A加入Spin Column中,12000 rpm离心30s,弃滤液。

11. 700 µLRinse B加入Spin Column中,12000 rpm离心30s,弃滤液。

12. 重复操作步骤11。

13. Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入25 µL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1min。

注意:使用加热至60℃的灭菌蒸馏水或Elution Buffer有利于提高洗脱效率。

14. 12000 rpm离心1min洗脱DNA。

-20℃低温保存纯化的目的DNA片段。